本生小課堂：小分子ELISA試劑盒的標(biāo)曲制作

　　小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夾心法的兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可采用競爭ELISA法模式。檢測原理是待測樣本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。樣本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等的ELISA測定多用競爭法。

　　實(shí)例講述

　　嘔吐毒素(DON)是其中最重要一種毒素，主要來自鐮刀菌屬，尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌。由于它可以引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素(vomitoxin，VT)。DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人畜攝入被DON污染的食物、飼料后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。HPLC等檢測方法前處理步驟繁瑣且費(fèi)用昂貴，ELISA方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，樣品前處理相對(duì)簡單等特點(diǎn)，可經(jīng)濟(jì)、快速地檢測大量樣品。

　　檢測原理

　　自主研發(fā)的嘔吐毒素(DON)ELISA試劑盒采用間接競爭ELISA方法。首先將嘔吐毒素抗原結(jié)合到酶標(biāo)板微孔條上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的嘔吐毒素與包被的嘔吐毒素抗原競爭生物素標(biāo)記的抗嘔吐毒素單抗上的結(jié)合位點(diǎn)，游離的成分被洗去。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，嘔吐毒素濃度與OD450值之間呈反比，樣本吸光值與其含有的嘔吐毒素成負(fù)相關(guān)。

　　數(shù)據(jù)分析

　　競爭ELISA法的結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第一種定性分析方法，而定量判定用第二種方法。競爭ELISA法的標(biāo)曲制作和濃度計(jì)算與雙抗體夾心法ELISA試劑盒明顯不同，具體詳細(xì)說明如下：

　　定性分析

　　用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.527，樣本2的吸光度值為1.225，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是：0ppb為2.044;5 ppb為1.758;15 ppb為1.368;45 ppb為0.783;135 ppb為0.287;405 ppb為0.092。則樣本1的濃度范圍是45ppb～135 ppb;樣本2的濃度范圍是15 ppb～45 ppb，再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中嘔吐毒素的濃度范圍。

　　定量分析

　　1、百分吸光率的計(jì)算

　　標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即

　　B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

　　B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

　　以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以嘔吐毒素(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，【注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值范圍需處于0-3之間;標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)出直線或類似直線形式，以增加標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算的擬合度，有利于提高樣本濃度測量準(zhǔn)確性】。本試劑盒中以嘔吐毒素(ppb)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別是：0ppb;5 ppb;15 ppb;45 ppb;135 ppb;405 ppb，5 ppb-405 ppb濃度間呈現(xiàn)出后一濃度為前一濃度的3倍，進(jìn)行對(duì)數(shù)計(jì)算

　　ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。